Swoją działalność uniwersytet rozpoczął w 1367 roku i prowadził wykłady na trzech wydziałach: sztuk wyzwolonych, medycyny i prawa.

Wydział sztuk wyzwolonych posiadał jedną katedrę, medycyna - dwie, a wydział prawa - osiem katedr, w tym pięć prawa rzymskiego.  Kazimierz Wielki nie uzyskał zgody od papieża Urbana V na uruchomienie najbardziej prestiżowego wówczas wydziału teologicznego. Uczelnia powstała na wzór włoski, była korporacją studencką, której rektora wybierali studenci spośród siebie. Studenci tworzyli samorząd niezależny od czynników kościelnych. Studenci mieszkali na kwaterach prywatnych, a pierwsza bursa studencka (zwana później Bursą Jagiellońską) powstała dopiero w 1409 r. na rogu ulic Gołębiej i Wiślnej. Ufundował ją dla studentów z Litwy i Rusi Jan Isner, pierwszy profesor teologii.